制備型SFC應(yīng)該怎么用

制備型SFC簡介
純化的目的是去除所有會影響產(chǎn)品質(zhì)量、造成環(huán)境污染、引入摻雜物或?qū)е庐a(chǎn)品受到污染的物質(zhì)1。化學(xué)意義上的純化是指分離物質(zhì)中的各組分并去除雜質(zhì)。從古到今，為了提高生活質(zhì)量，人們運(yùn)用各種方法來分離和純化化學(xué)物質(zhì)。從藥物發(fā)現(xiàn)到化工材料、天然產(chǎn)物和食品生產(chǎn)，純化都是必不可少的。總體而言，純化的目的是分離物質(zhì)、改變混合物組成或去除干擾物2。具體而言，研究人員進(jìn)行純化的目的多種多樣，包括結(jié)構(gòu)解析、活性研究、產(chǎn)品配方和產(chǎn)物富集、雜質(zhì)分析等等。面對純化挑戰(zhàn)，市面上有許多復(fù)雜程度和效果各不相同的解決方案。然而，如何實(shí)現(xiàn)化合物的高通量分離通常是提升效率的瓶頸。因此，人們迫切需要更快、更高效的純化工具3。超臨界流體技術(shù)(SFx)包括一系列基于CO2的技術(shù)，專為精簡純化工作流程而設(shè)計(jì)，制備型超臨界流體色譜(Prep SFC)就是其中之一。本初學(xué)者指南將介紹Prep SFC用作純化技術(shù)的原理、應(yīng)用、儀器和工作流程。

SFX技術(shù)簡介
SFC純化的基礎(chǔ)是超臨界流體技術(shù)(SFx)。沃特世SFx技術(shù)包括超臨界流體萃取(SFE)、分析型色譜(UPC2)和制備型色譜(Prep SFC)，它們都以亞臨界或超臨界狀態(tài)的CO2為主要溶劑。SFx技術(shù)采用CO2替代液態(tài)有機(jī)溶劑和水性溶劑，是液相純化技術(shù)的正交技術(shù)，而且更加環(huán)保和經(jīng)濟(jì)有效。之所以說SFx是一項(xiàng)“綠色”技術(shù)，是因?yàn)樗划a(chǎn)生有機(jī)廢液，可減少環(huán)境影響。相較于LC純化，SFx在速度和選擇性方面均有顯著提升，這意味著從復(fù)雜原料到終產(chǎn)物所需的時間和成本大大降低。隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，各種純化應(yīng)用越來越明顯地體現(xiàn)出SFx技術(shù)帶來的分離能力優(yōu)勢.

以CO2為溶劑

超臨界流體是流體壓力和溫度超過臨界值的產(chǎn)物。在臨界點(diǎn)處，氣液兩相間的界面消失，此時高度壓縮氣體的密度與液體密度相近。超臨界流體還具有類似于氣體的高擴(kuò)散性和低粘度。其溶解能力主要與密度相關(guān)，而密度可通過控制壓力和溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。一般來說，密度越大溶解能力越強(qiáng)?，降低溫度或增大壓力均可增大密度。另一方面，升高溫度或減小壓力則會使密度變小?。圖1所示為CO2的相圖，展示了CO2從一種狀態(tài)到另一種狀態(tài)的物理變化及其臨界點(diǎn)。

 

圖1. CO2相圖；展示了CO2從一種狀態(tài)到另一種狀態(tài)的物理變化及其臨界點(diǎn)。

很多物質(zhì)在極端條件下才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌R界狀態(tài)，而且在該狀態(tài)下會表現(xiàn)出某些不良特性。表1所示為幾種物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槌R界流體的條件及其在此狀態(tài)下的特性。不同于其它超臨界物質(zhì)，CO2不可燃、無爆炸危險(xiǎn)、無毒性或腐蝕性，因此通常被認(rèn)為是一種十分安全的物質(zhì)3。此外，CO2的超臨界狀態(tài)（31 °C，74 bar）很容易得到，因此人們能夠在可接受的溫度和壓力范圍內(nèi)控制其密度?。不僅如此，由于臨界溫度相對溫和，它還適用于處理熱不穩(wěn)定樣品。CO2還易于通過其它工業(yè)工藝回收，因而價(jià)格相對低廉；這意味著它對環(huán)境CO2水平的影響是中性影響?。上述所有優(yōu)勢使得CO2成為了超臨界流體技術(shù)最常用的物質(zhì)。

 

表1. 幾種物質(zhì)的臨界溫度和壓力，以及這些物質(zhì)值得注意的性質(zhì)。

SFX純化工作流程
純化工作流程由多個步驟組成，其復(fù)雜性和必要性根據(jù)應(yīng)用要求而異。最基本的SFx純化工作流程包括以下方面（圖2）：

 

圖2. 完整SFx工作流程的示意圖。

原料或樣品：樣品可能很復(fù)雜（例如天然的植物性樣品），也可能相對簡單（例如經(jīng)過準(zhǔn)確表征的候選藥物），這將決定需要進(jìn)行何種程度的樣品制備（如果需要）以及純化的規(guī)模。盡可能收集有關(guān)樣品和最終產(chǎn)品的信息（例如熱穩(wěn)定性、極性、溶解度和反應(yīng)性）也很重要，這些信息將決定樣品的處理方式。

樣品制備：純化的第一步需要根據(jù)原料狀態(tài)和應(yīng)用的目的或適用范圍正確地制備樣品。樣品制備可能包括研磨、干燥、提取和過濾等多個步驟，也可能只需溶解樣品將其制成溶液。超臨界流體萃取(SFE)是SFx工作流程的第一步（即樣品制備）。該技術(shù)通常用于涉及工業(yè)粗制品、植物性材料或天然產(chǎn)物的應(yīng)用。

樣品純化：純化的作用是降低樣品復(fù)雜性，或者分離出純度達(dá)到指定范圍的終產(chǎn)物進(jìn)行分析或用于產(chǎn)品配方。通過SFE制備的樣品通常是含有目標(biāo)化合物和雜質(zhì)的復(fù)雜混合物。作為SFx工作流程的第二個步驟（純化），制備型超臨界流體色譜(Prep SFC)會從提取物中純化出一種或多種目標(biāo)物質(zhì)。Prep SFC還可應(yīng)用于多種其它方法制備的樣品，而不僅僅局限于SFE法制備的樣品。

終產(chǎn)物：獲得終產(chǎn)物是工作流程的最終目標(biāo)。它可以是分析得到的數(shù)據(jù)和信息、某種工藝所需的精煉原料，或者是可直接使用的終產(chǎn)物。終產(chǎn)物決定了成功的工作流程所需的儀器和方法。在SFx工作流程中，提取(SFE)和純化(Prep SFC)之前及之后的樣品分析由超高效合相色譜(UPC2)完成。

上述SFx技術(shù)中的任何一種都可以根據(jù)需要用于非SFx工作流程中的樣品制備、純化或分析步驟。

PREP SFC簡介
制備型色譜：HPLC到SFC的沿革

過去20年來，制備型高效液相色譜(Prep HPLC)一直都是最常用的純化技術(shù)之一?。具體而言，該技術(shù)是精細(xì)化學(xué)品、制藥和生物技術(shù)行業(yè)普遍使用的一種分離工藝，被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)品純化?。在這期間，Prep HPLC已發(fā)展成為一種非常高效且適用性極廣的技術(shù)，尤其是在非手性純化領(lǐng)域。反相液相色譜(RPLC)的優(yōu)勢是采用幾乎通用的固定相(C18)，以及由水和乙腈組成的通用混合流動相。RPLC兼容質(zhì)譜(MS)分析，它與MS聯(lián)用(RPLCMS)已成為許多研究環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)純化方法?。

盡管應(yīng)用廣泛，Prep HPLC也存在諸多缺點(diǎn)。相較于處理的總樣品量，純化一定質(zhì)量合物的流動相用量相當(dāng)大。典型的Prep HPLC餾分含有大量溶劑（包括有機(jī)溶劑和水性溶劑），分析人員需要花費(fèi)大量時間和精力來干燥和獲取終產(chǎn)物，這極大限制了純化效率。LC所用的溶劑會污染局部環(huán)境（通過蒸發(fā)或接觸）和大氣環(huán)境（通過化學(xué)廢棄物焚燒）。正相液相色譜(NPLC)對環(huán)境的危害更大，因?yàn)槠淞鲃酉嗤ǔＪ羌冇袡C(jī)溶劑。鑒于上述環(huán)境問題，購買和處置LC流動相溶劑的成本越來越高；因此人們迫切需要一種對溶劑依賴程度更低或更環(huán)保的純化方法?。SFC正是這樣一種替代方案，它有助于突破效率瓶頸，同時可帶來縮短用時、減少廢液和降低成本的優(yōu)勢?。最近，SFC儀器方面的進(jìn)展使得該技術(shù)作為手性和非手性純化的一種有用工具再次成為人們的關(guān)注焦點(diǎn)?。在分析和純化領(lǐng)域，SFC是比HPLC更加環(huán)保的替代方法6,3。

SFC也是色譜！

超臨界流體色譜(SFC)是一種色譜技術(shù)，其使用亞臨界（液態(tài)）和超臨界CO2作為流動相的主要溶劑，通常還需搭配有機(jī)溶劑使用。和所有色譜技術(shù)一樣，SFC技術(shù)也基于分析物在固定相（色譜柱）和流動相（溶劑）之間的分配來分離各組分?。HPLC與SFC有許多相似之處，例如：SFC可在等度和梯度方法條件下運(yùn)行，并且兼容所有標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)，如紫外(UV)檢測、光電二極管陣列(PDA)檢測、蒸發(fā)光散射(ELS)檢測和質(zhì)譜(MS)檢測。常規(guī)Prep SFC工作流程與HPLC的相同，包括方法開發(fā)、放大、餾分收集，以及對收集到的餾分進(jìn)行純度分析（圖3）。SFC的回收率和樣品純度可媲美RPLC，在某些應(yīng)用中SFC的回收率較高，而對于其它應(yīng)用，HPLC是更好的解決方案?。

 

圖3. 制備型色譜工作流程。

SFC一般采用正相色譜分離原理。SFC與HPLC的不同之處在于，SFC采用CO2替代非極性液態(tài)組分（例如正己烷和庚烷）作為流動相的主要組分?。由于超臨界CO2是可壓縮流體，因此壓力和溫度是控制溶劑強(qiáng)度，進(jìn)而影響色譜保留性和選擇性的重要參數(shù)7,9。超臨界CO2是色譜純化的理想之選，因?yàn)槠洳豢扇肌o毒并且具有高擴(kuò)散性、低粘度和出色的溶解能力10。近年來，得益于節(jié)省溶劑和高效率的優(yōu)勢，SFC備受純化實(shí)驗(yàn)室青睞。

PREP SFC的優(yōu)勢：節(jié)省溶劑
由于采用CO2替代了大部分流動相，Prep SFC關(guān)鍵優(yōu)勢是溶劑用量少?。這一優(yōu)勢在分析型分離中也許并不明顯，但在制備型分離中效果相當(dāng)顯著。許多純化實(shí)驗(yàn)室都需要花費(fèi)相當(dāng)多的時間從餾分中去除溶劑，這極大制約了化合物純化完成后獲得目標(biāo)產(chǎn)物或結(jié)果的效率。若采用Prep SFC，流動相中的CO2通過降壓即可除去，只剩下少量助溶劑。所得餾分中的產(chǎn)物濃度也更高，縮短了去除溶劑和產(chǎn)物分離所需的時間?。餾分還可以直接進(jìn)行分析，無需樣品富集或濃縮。對于那些在普通長時間干燥條件下會發(fā)生降解的化合物而言，這一點(diǎn)至關(guān)重要3。

SFC有機(jī)溶劑用量較低帶來的其它優(yōu)勢還包括節(jié)約成本、更安全（就可燃性和毒性角度而言），以及對環(huán)境影響更小等等。在溶劑購買和處置方面，SFC的成本優(yōu)勢相當(dāng)可觀；除此之外，由于去除溶劑所需的能耗更低，還能進(jìn)一步節(jié)省成本?。SFC還可避免使用有毒溶劑，例如RPLC使用的乙腈以及NPLC使用的脂肪烴和氯化物溶劑。作為其它工業(yè)工藝的副產(chǎn)物，CO2價(jià)格相對低廉，而且可以循環(huán)使用。

PREP SFC的優(yōu)勢：提高效率
SFC效率的提升得益于流動相的低粘度和高擴(kuò)散性對色譜分析速度和效率的提升3。圖4比較了HPLC、UPLC、SFC和UPC2的Van Deemter曲線。在色譜分析中，分離速度部分取決于溶質(zhì)在流動相中的擴(kuò)散速度11及其進(jìn)出固定相的速度。SFC的Van Deemter曲線比HPLC更寬更平，這表示SFC在流速（線性流速）增大的情況下仍能保持較高的色譜效率（低塔板高度）。SFC的高擴(kuò)散系數(shù)直接轉(zhuǎn)化成了更快的色譜分析速度11。

 

圖4. HPLC、SFC、UPLC和UPC2的Van Deemter曲線。

由于流動相粘度較低，色譜柱和系統(tǒng)壓力也較低，因此可采用高達(dá)HPLC流速3~4倍的線性流速以及粒徑更小的色譜柱6,7。此外，低粘度還能縮短平衡時間。這樣一來，運(yùn)行時間縮短，分離效率提高，進(jìn)而可增大載樣量并縮短進(jìn)樣周期；這些對于任何制備型色譜分離而言都是提高效率的關(guān)鍵參數(shù)。因此，SFC得以在更短的時間內(nèi)獲得純化合物，從而提高總體工作效率6,7。表2給出了SFC相較于HPLC在時間和工作效率方面實(shí)現(xiàn)提升的示例3。

表2. 制備型SFC與制備型HPLC對比（示例數(shù)據(jù)由默克公司(Merck & Co.)提供）3。

PREP SFC是反相液相色譜RPLC的正交技術(shù)

利用SFC與RPLC的正交關(guān)系可提高多種應(yīng)用的產(chǎn)物質(zhì)量。采用C18色譜柱的RPLC是一種幾乎通用的解決方案，能夠極大簡化方法開發(fā)過程，但由于其使用水性流動相，溶劑兼容性和化合物溶解性非常有限。另一方面，SFC可配合多種有機(jī)稀釋劑使用，對溶劑和化合物的兼容范圍更廣。此外，SFC可選用的固定相也非常豐富。

之所以說SFC是RPLC的正交檢測技術(shù)，是因?yàn)镾FC一般被視為正相色譜，并且可提供多種易于操作的色譜分離選項(xiàng)。由于兼具正相選擇性和高分離效率，SFC在立體異構(gòu)體、位置異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)相似化合物分離方面的優(yōu)勢尤其明顯?。對于非極性化合物，SFC的靈活性允許分析人員采用反相色譜柱（例如C18），同時以水作為添加劑，將應(yīng)用擴(kuò)大到極性更強(qiáng)的范圍10。對于化合物易降解的應(yīng)用，SFC純化更是理想的替代解決方案，因?yàn)镾FC方法分離速度快、不使用水，并且餾分干燥步驟能在低溫條件下快速完成。

rep SFC的回收率和純度可媲美RPLC，某些應(yīng)用采用SFC和RPLC均可。一項(xiàng)研究篩查了SFC和LC純化對某制藥化合物數(shù)據(jù)庫中化合物的適用性，所得結(jié)果如圖5所示。約82%的化合物采用兩種純化技術(shù)均可純化12。但除此之外，該研究還證明了這兩種純化平臺的互補(bǔ)性。部分化合物只能通過SFC法純化(4%)，還有一部分化合物只能通過LC法純化(8%)。兩種純化平臺聯(lián)用所帶來的靈活性為優(yōu)化分離和純化方案提供了更多可能性。SFC的選擇性與RPLC互補(bǔ)，因此我們可在方法開發(fā)過程中引入正交技術(shù)用于分離復(fù)雜的棘手樣品?。采用跨平臺多步純化方案或使用正交技術(shù)進(jìn)行餾分分析，可獲取純度更高的產(chǎn)物和更豐富的信息。圖6所示為采用正交的LC和SFC分離方法純化某復(fù)雜基質(zhì)中所含化合物的示例。

 

圖5. 使用SFC和LC方法篩查化合物純化成功率所得的餅圖12。

 

圖6. 采用兩步正交純化法（LC為第一步，SFC為第二步）純化某天然產(chǎn)物提取物中目標(biāo)化合物的示例。