制備型液相色譜（LC）簡介
色譜是根據混合物中各組分的化學特性對其進行分離的一種分離方法。制備型(Prep)色譜或純化色譜則是指利用色譜方法分離出一定量達到足夠純度的化合物用于后續實驗或處理的色譜方法?？茖W家首先要確定目標化合物，然后開發色譜方法，將目標化合物從原料、副反應或其它雜質中成功分離出來。其總體目標是滿足日益增長的高通量和高效率需求，同時運用各種純化技術達到相應的規模、純度和重現性要求。
從大型制藥企業到小規模天然產物研究團隊，純化色譜在眾多科研機構中應用非常廣泛。盡管應用領域各不相同，用戶的一般要求卻非常相似，他們都希望分離出的終產物純度能達到95％或更高。
本初學者指南旨在為液相色譜工作者介紹快速發展的LC純化領域，內容包括色譜分離方法開發、方法放大所需的數學公式以及常用的餾分收集模式等基本原理。鑒于大多數制備型LC應用都使用反相分離模式，本指南將主要介紹該分離模式。
采用液相色譜進行純化
LC純化系統的配置與一般液相色譜系統相同，但增加了餾分收集器。樣品混合物被進樣至色譜柱，色譜柱根據組分特有的化學或物理性質對其進行分離。檢出組分時，系統會將其輸送至廢液，或者進行收集用于后續實驗。洗脫液收集操作既可由分析人員在組分洗脫時通過簡單的手動方式完成，也可以全自動進行，在自動收集操作中，檢測器信號會觸發餾分收集器將液流輸送至收集容器中。輸送至收集容器的餾分純度取決于分離過程中化合物與其它鄰近洗脫雜質的分離度。
圖1：制備型LC系統
判斷純化分離成功與否的標準包括通量、回收率和所得分離物的純度。純化分離由色譜峰的分離或“分離度”驅動。以下是對分離度影響最為顯著的色譜參數：
- 色譜柱填料（固定相）
- 溶劑強度
- 溶劑類型
- 緩沖液添加劑
- 柱溫
通過執行方法開發工作流程，可確定實現理想分離度的條件。該工作流程非常簡單，但包含多個步驟，各步驟的復雜性和必要性根據樣品的獨特性質而異。無論樣品分離用于何種應用、采用哪種模式（例如反相色譜、離子交換色譜等），方法開發工作流程通常都是相同的。
圖2：通用制備型工作流程
在設計工作流程之前，十分重要的考慮因素是目標化合物的性質。如果從熟知的來源或新來源中分離已知化合物，很容易通過檢索相關文獻獲取有關目標化合物色譜行為的信息，并從已發表的方法中選擇適用的分離方法。而對于含有未知類型化合物的粗提取物，設計分離方案的難度較大。在這種情況下，可在初始分離之后進行一系列探索性實驗，獲取更多有關目標化合物的信息，例如pKa、分子量、溶解性、穩定性、UV光譜和生物活性等。然后根據這些信息修改初始分離方法，使其符合化合物的化學和物理性質要求。這些信息不僅有助于方法開發，還可以在收集到餾分之后，為掌握目標產物的穩定性提供非常大的幫助。
第一步要制備樣品并使用快速探索梯度執行常規分離。這一步通常為小規模分離，目的是節省寶貴的樣品。根據該分離的結果，可以計算洗脫目標化合物的溶劑條件并進一步優化分離條件，盡可能提高分離度。此外，可能還需要對上樣量進行研究，確定可維持適當分離度以實現高純度分離的理想上樣量。
確定分離方法和理想上樣量后，通常要針對具有應用前景或潛在價值的分離物進行方法放大（但并不是必須執行）。在本初學者指南中，術語“規?！?scale)旨在描述滿足產物純度、通量和收率等應用目標所需的儀器和方法。若要“放大”(scaled-up)方法，則需要將方法轉換至硬件配置可處理更高上樣量的系統。從本質上來講，方法放大就是借助一系列方法放大計算和硬件更改，在分離度保持不變的前提下，將方法從分析級內徑色譜柱轉換到制備級內徑色譜柱的過程。
圖3：用于分析級和制備級純化的色譜柱內徑對比
樣品
可用于分離特定化合物的樣品來源十分廣泛，包括藥物中間體、天然產物、保健食品、飲料和工業產品等。只要原料可以進行提取并溶解于液體基質中，就可以使用色譜純化其中的各組分。
樣品提取技術的選擇取決于待提取原料的復雜性。對于天然產物，通常將樣品干燥并研磨成細顆粒用以提高提取效率。接下來采用滲濾（用于大體積樣品）或浸提（用于小體積樣品）等技術提取目標化合物。這兩種技術都需要向樣品原料中加入溶劑，然后在超聲、渦旋或浸泡后收集溶質。收集提取物之后，和所有HPLC樣品一樣，樣品在進樣前必須過濾，以除去顆粒并排除氣泡。
分離模式
制備型色譜主要有四種分離模式：反相、正相、凝膠滲透和離子交換。合適的分離模式取決于待分析樣品、提取物或混合物與固定相和溶劑之間的相容性。
反相色譜是開發純化方法時最常用的技術，其使用極性弱于洗脫溶劑極性的固定相。反相色譜使用水與乙腈或甲醇的混合物作為洗脫液，其中還會添加緩沖液（酸或堿）用于控制樣品的離子化程度以及結合固定相中未反應的游離硅醇基團。硅膠型固定相中的鍵合相材料或吸附劑采用甲硅烷基化試劑進行了衍生化處理，可減少峰拖尾并提高色譜重現性。上述衍生化試劑處理（硅烷化）以及不同的碳載量將賦予不同制造商的色譜柱獨特的分離特征1。
快速啟動方法開發
建立反相分離方法時，通常選擇小規格的分析型色譜柱（內徑≤ 4.6 mm），并且其柱長和填料應可擴展至較大規格（內徑≥ 10 mm）內徑的色譜柱，以便將來放大方法。方法開發的關鍵是找到可實現出色分離的適用溶劑體系。對于酸性化合物，通常采用pH為酸性的水性流動相，并以甲醇或乙腈作為強溶劑。濃度為0.1%的甲酸是常用的緩沖液添加劑，因為其兼容UV和質譜檢測。如需鑒定未知化合物或獲取純分離物用于進一步研究，MS兼容性將非常有用。如需讓堿性分子保持未電離狀態，可使用pH為堿性而非酸性的流動相。使用任何pH的緩沖液之前，都應參閱色譜柱固定相說明書了解其兼容性。水性流動相通常由位置A處的泵泵送，強溶劑由位置B處的泵泵送。本初學者指南將分別使用“A”和“B”指代泵表中的水性溶劑和強溶劑。
探索
盡管復雜的分離受色譜柱填料選擇性的影響最大，但在開發純化分離方法時，通過快速探索梯度得到初始樣品分離方法并優化是十分有效的方法開發途徑。探索梯度的作用是大致確定從色譜柱上洗脫目標化合物所需的溶劑濃度。探索梯度一般從一致的強溶劑濃度(2%-10%)開始，線性增加至25%、50%、75%和90%-95%。
表1：快速線性梯度探索研究示例
圖4：快速探索梯度。隨著梯度斜率減小，分離度增大2
運行探索梯度之后，在進行下一步之前應審查并評估所得結果，弄清以下問題：
- 快速探索梯度的分離度是否足以分離目標化合物？
- 快速探索梯度的速度或效率是否滿足要求？
- 采用所需上樣量時，目標化合物與其它峰能否保持分離？
如果探索梯度結果未達到要求，可通過方法聚焦進行優化，也可通過更改pH值、溶劑或其它色譜變量對分離方法進行整體調整。
優化方法
通過改變強溶劑和弱溶劑組成可優化目標化合物分離度理想的探索梯度。溶劑組成可以保持恒定（等度），也可以根據給定的單位時間或色譜柱體積進行變化（梯度）。
等度洗脫
在等度分離中，弱溶劑和強溶劑比率在單位時間內保持不變。等度溶劑可由分析人員離線制備，或使用能以恒定的預定流速配比不同溶劑的HPLC泵通過在線混合制得。這種洗脫模式便捷、一致且穩定，因為在系統間轉移方法時，延遲體積對保留時間的影響可以忽略不計。
等度洗脫有一定缺陷，并不是所有分離都適用。它的一些固有問題包括：早期洗脫峰分離度低、因峰拖尾導致峰對稱性不佳、由于譜帶增寬導致靈敏度降低，以及由于強保留化合物積累導致色譜柱污染問題等。
梯度洗脫
反相色譜或離子交換色譜中的梯度分離通常在線混合流動相，以便在整個分析過程中使有機溶劑比例穩定升高。梯度開始時，溶劑強度較低，分析物會被分配到固定相中或保留在色譜柱柱頭。隨著溶劑強度增加，分析物被轉移到流動相，沿色譜柱移動，最終被
洗脫。
梯度洗脫可在合理的時間范圍內分離疏水性不同的多種分析物。另外，梯度洗脫還可提高峰分離度，由于峰高增加，靈敏度也有所提升。強保留組分會在運行結束時從色譜柱中洗脫出來，因此還可盡可能減少色譜柱污染。
當然，梯度洗脫也存在一些弊端。該方法要求實現一致、無脈沖的在線梯度混合，因此通常需要昂貴的泵設備。此外，采用某些溶劑的組合混合流動相時，可能會產生沉淀。由于梯度結束后需要重新平衡，運行時間會很長，而且因為儀器駐留時間(Vd)不同，若
不適當使用補償溶劑，會帶來方法轉換問題。
線性梯度
在整個運行過程中，線性梯度的強溶劑比例以恒定速率增加。該方法常在快速篩選實驗中被用于快速確定洗脫目標峰的溶劑比例，同時保持較短的運行時間，從而縮短洗脫時間并降低溶劑成本。
圖5：線性梯度的溶劑曲線
分段梯度
分段梯度是多個線性梯度的組合，每個區段具有不同的斜率或陡度。平緩的區段用于分離目標化合物，而陡峭的區段是對色譜圖分離度要求不高的區域（例如分離后的清洗過程）。
圖6：分段梯度的溶劑曲線
梯度聚焦
梯度聚焦通常比分段梯度的運行時間更短且變化更大。一般情況下，剛進樣時流動相的溶劑強度非常低，接下來溶劑強度會迅速升至洗脫目標化合物所需的溶劑比例以下2%-5％（例如，洗脫濃度22% - 2％ = 20％開始平緩梯度）。然后運行平緩梯度，梯度斜率約為快速探索分離所確定的斜率的1/5，最后終止于目標化合物的洗脫濃度以上2%-5％（例如，22% + 2% = 24%終止平緩梯度）。最后，溶劑百分比快速增加，用以清洗殘留在色譜柱中的所有樣品組分。
圖7：梯度聚焦的溶劑曲線
開發梯度聚焦
采用快速探索梯度分析樣品之后，可利用以下公式為目標化合物開發梯度聚焦。每個公式之后都附有理論示例。
首先必須確定探索梯度運行所用儀器的系統延遲體積。關于延遲體積測定的說明可參閱本初學者指南的“延遲體積測定”部分，或訪問www.waters.com/prepcalculator ，使用“分析級至制備級梯度轉換器”應用工具獲取。
此外，還需確定探索梯度運行所用色譜柱的柱體積。使用圓柱體體積V = πr2h和除去填料所占體積之后的可用柱體積比例可計算出該值，例如V = πr2h (66%)?！胺治黾壷林苽浼壧荻绒D換器”應用程序工具也可用于執行此計算。
公式1：色譜柱體積
公式2：梯度形成和檢測器之間的補償體積
公式3：到達檢測器所需的時間到達檢測器所
公式4：達到洗脫濃度的時間
公式5：洗脫濃度(%)
公式6：色譜柱體積(CV)數
公式7：探索梯度斜率
公式8：梯度聚焦斜率
梯度聚焦區段為：估算洗脫比例以下5%至該比例以上3%~5%。例如，洗脫比例為79％。
公式9：梯度聚焦區段的時長
最后一步是使用上述公式計算出的值創建梯度聚焦。
探索梯度:
|
時間 (mins) |
流速 (mL/min) |
溶劑 |
|
|
%A |
%B |
||
|
0.00 |
1.5 |
95 |
5 |
|
7.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
8.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
9.00 |
1.5 |
95 |
5 |
梯度聚焦:
|
時間 (mins) |
流速 (mL/min) |
溶劑 |
|
|
%A |
%B |
||
|
0.00 |
1.5 |
95 |
5 |
|
1.00 |
1.5 |
26 |
74 |
|
4.32 |
1.5 |
16 |
84 |
|
6.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
7.00 |
1.5 |
95 |
5 |
圖8：采用快速梯度和梯度聚焦分離萘普生、苯氧苯丙酸、雙氯芬酸和異丁苯丙酸所得的結果對比。可以看到用星號標記的目標峰在梯度聚焦分離中分離度更高且保留時間更短
替代方法開發
如果等度分離或梯度聚焦都不能完全分離目標化合物，可以通過更改溶劑、pH值、固定相和/或溫度重新開發分離方法。這類修改會對分離產生顯著影響，因此進行以上任何更改之后都必須運行探索梯度并進行方法優化。
溶劑
HPLC流動相由三種組分組成：弱溶劑、強溶劑和改性劑。溶劑必須具有高純度、可與檢測器兼容、不與樣品反應，并且粘度應較低，以保持低系統背壓。
反相色譜通常以水作為弱溶劑，常用的強溶劑是乙腈和/或甲醇，因為它們粘度低、溶劑強度高，并且在短波長范圍內兼容UV檢測。此外，乙腈和甲醇還能提供理想峰形，分離之后易于通過蒸發去除，而且不與大多數樣品反應。
和所有用于色譜分離的溶劑一樣，分析樣品時必須保持檢測波長高于已知的溶劑UV截止波長值。若波長低于該值，檢測器會將溶劑組分變化記錄為基線漂移或其它色譜干擾。
表2：常用色譜溶劑及其UV截止波長
峰分離和出峰順序會根據分離所用的強溶劑不同而改變。預測可使目標化合物達到最高分離度的溶液非常困難，因此，通常需要通過試錯法來確定強溶劑?；蛘?，也可以使用混合強溶劑（例如，50:50乙腈/甲醇）達到理想的洗脫順序或分離度。
圖9：乙腈和甲醇的洗脫順序對比3
pH值
流動相pH值是控制反相分離保留性的一個非常重要的變量。化合物通常都含有一個或多個酸性或堿性官能團，因此大多數反相流動相的pH值都有必要加以控制。
當酸的pH高于或低于其pKa 2個以上pH單位時，99％以上的酸將分別處于電離或未電離狀態。相反，堿在pH值低于其pKa時電離，在pH值高于pKa時為未電離狀態。未電離物質的極性較?。ǜ杷蚨诜聪囿w系中保留性更強。因此，酸在低pH值條件下保留性更好，而堿在高pH值條件下保留性更好?。
圖10：流動相pH值對分析物保留性的影響。選擇對應于保留圖穩定區域的流動相pH值可實現十分穩定的分離。非電離形式的酸和堿保留性非常理想，而中性分析物的保留性不受pH值影響
如果流動相pH值接近目標化合物的pKa，則很小的pH值變化也會顯著影響其保留性，從而直接影響分離穩定性。我們通過添加緩沖液來控制流動相pH值。加入少量酸或堿時，緩沖液可保持pH值不變。緩沖液在其pKa ±1個pH值單位范圍內使用十分有效，不過有的緩沖液在其pKa ±2個pH值單位范圍內也具有足夠的緩沖能力。
圖11：化合物選擇性與pH值。酸性和堿性化合物的洗脫順序因其電離情況不同而發生了顯著變化，而中性化合物未受影響
在選擇運行pH值時，還應考慮色譜柱穩定性。硅膠基色譜柱在pH 2至pH 8之間性能非常理想。鍵合相在低pH值下易水解，而在高pH值下，硅膠主鏈會變得易溶解。當pH值高于8時，需要使用非硅膠基質顆?；蚓哂袑Ｓ面I合相（在高pH值條件下穩定）的顆粒。pH值限值和通用處理建議可參閱色譜柱說明書或訪問色譜柱制造商網站。
圖12：基于沃特世表面帶電雜化(CSH)硅膠基質的專用鍵合相示例及其建議pH值范圍
當色譜方法用于純化目的時，用于調節pH的緩沖液添加劑必須具有足夠的揮發性，以便從純化后的分離物中去除。此外，使用揮發性添加劑時，必須注意避免MS源被污染或產生沉淀。甲酸、乙酸和醋酸銨等常用添加劑以0.05%~0.1％的濃度溶解于流動相時性能非常理想。不建議在純化或MS應用中使用液相色譜分離最常用的緩沖液添加劑 - 磷酸鹽。
建議的緩沖液濃度為5~10 mM。如需使用緩沖液，應在制備完成后進行過濾，不使用時應沖洗泵管路，以避免在線沉淀，還需定期更換溶液以防止微生物生長積聚。
圖13：流動相緩沖液選擇指南，附MS兼容性
固定相
色譜柱固定相會顯著影響分離。反相色譜使用C18到C8的固定相，某些固定相還含有專為提高選擇性和分離能力而設計的鍵合相。許多實驗室的色譜柱庫存有限，因此更換固定相通常是調整溶劑和pH值均無法達到足夠分離度時的最后選擇。沃特世常見色譜柱選擇卡(www.waters.com)可對比不同制造商色譜柱固定相的選擇性。在方法開發的早期階段，該工具非常適合用于比較色譜柱選擇性。
圖14：沃特世常見色譜柱選擇卡，可通過www.waters.com/selectivitychart 上的Web Toolbox（網絡工具箱）訪問
柱長
色譜柱柱長也是影響分離性能的因素之一。市面上有多種色譜柱柱長可供選擇，包括25 mm、50 mm、100 mm、150 mm和250 mm。較短的色譜柱塔板數較少，適用于快速分離，而較長的色譜柱塔板數較多，因此保留時間較長。隨著柱長增加，柱壓、運行時間、溶劑消耗量和成本也會相應地增加，因此能夠達到足夠分離度的盡可能短的色譜柱是十分理想的選擇。
圖15：不同柱長色譜柱的分離度對比。100 mm色譜柱改善了主峰與鄰近雜質之間的分離度，總運行時間隨柱長增加而延長3
粒徑
樣品流經填料時，色譜柱阻止樣品譜帶擴散或展寬的能力稱為“柱效”。由于小顆粒內的峰擴散較低，小粒徑色譜柱的柱效更高。高柱效可使峰寬更窄，賦予色譜柱更強的分離能力。
制備型色譜柱的粒徑通常為5~10 μm，超高壓分析型分離則使用粒徑為1.7~3.5 μm的色譜柱。雖然極小的粒徑可帶來更高的柱效，但代價是色譜柱成本和系統背壓增加。出于以上原因，以較高流速分離粗制樣品混合物的大規模制備型色譜柱一般不會采用粒徑非常小的顆粒。
圖16：采用不同粒徑色譜柱分離相同物質的色譜結果對比3
溫度
由于不同的溫度會影響色譜選擇性，因此加熱色譜柱是優化具體樣品分離結果的一種非常方便的手段。流動相粘度和系統整體壓力隨溫度升高而降低，進而降低系統、接頭和色譜柱壓力，最終有利于提高運行的穩定性。調節溫度還可縮短保留時間并改變分離的選擇性。峰分離度會隨溫度變化增大還是減小很難預測，因而溫度對于每次具體分離有特定的影響。
盡管溫度控制是小規模色譜的常規控制手段，但制備級純化很少將溫度作為操控色譜分離的參數。首先，大內徑色譜柱難以從外部均勻加熱。其次，大規模的高流速分離中通常會保持流入溶劑的溫度。雖然電熱毯和柱溫箱可滿足小規模分離的加熱需求，卻無法在直徑方向上均勻加熱大型色譜柱。因此，色譜柱直徑方向上會形成溫度梯度，對色譜分離產生不利影響。
若必須借助溫度控制來保持樣品溶解性，可在制備型色譜柱柱頭處連接一段管路，并將其放置在加熱的水浴中，以消除溫度梯度。這一段管路被用作預加熱器，將流入溶劑平衡至所需溫度?。將來需要放大的色譜方法最好在室溫條件下開發，盡量不使用溫度控制手段。
圖17：制備級色譜柱加熱。制備型色譜柱柱頭連接的5 mL定量環浸沒在水浴中，用作溶劑預加熱器?
方法放大
若初步證明某分離物具有潛在價值，可“放大”分離方法，分離出更大量的該分離物以供進一步評估。要在大規模分離中維持小規模分離的各項屬性（如分離度等）很容易。必須借助已定義的數學公式修改流速、上樣量和系統硬件參數，從而有效地將分離方法
轉移至更高容量的色譜柱。
方法放大的第一階段通常是獲取mg級到g級的分離物用于從早期生物學評價到建立具有改進治療特性的產品類似物的結構 - 活性關系等多種用途。方法放大的下一階段需要獲取100 g到數千克（或更多）的目標物質用于臨床前和臨床開發，如果開發成功，將最終決定全面投產。這種規模的分離要用到良好生產規范(cGMP)等指導文件和質量控制手段1。
表3：色譜規模、目標物質量和相關應用。
方法放大工作流程分為幾個步驟。必須保證放大計算的準確性，否則最終可能無法達到小規模分離的分離度。為了提高方法放大的成功率，同時維持保留時間和選擇性不變，需要仔細考慮以下要求：
- 小規模和大規模分離必須使用相同的流動相。
- 使用填料、柱長和粒徑相同的色譜柱非常容易進行方法放大（或者在保持初始方法的柱長-粒徑比率(L/dp)不變的前提下改變粒徑）。
- 應使用相同的稀釋溶劑制備濃度相同的樣品。
圖18：方法放大工作流程。
確定延遲體積
在放大方法或更改系統時，延遲體積（即系統體積或死體積）對于維持早洗脫峰的峰分離度很重要。延遲體積是指梯度形成處到色譜柱柱頭之間的體積。在高壓混合LC系統中，該體積主要包括混合器、連接管路和自動進樣器定量環的體積。低壓混合系統包括來自泵的上游溶劑，因此這些額外的管路體積加上泵頭（一個或多個）體積，再加上混合器、連接管路和自動進樣器定量環的體積共同組成了總延遲體積。
圖19：導致延遲體積的純化流路組件（用虛線圈出）。
等度分離的流動相組分通過在線方式混合，這種情況下仍然存在延遲體積，但由于流動相濃度恒定，色譜分離結果中觀察不到差異。另一方面，梯度方法則依賴流動相濃度隨時間的變化實現峰分離。在梯度方法中補償延遲體積可確保峰保留時間得以維持，需要收集純餾分時，這一點尤為重要。
如需測定延遲體積，可根據www.waters.com/prepcalculator 上的“分析級至制備級梯度轉換器”所用的方法，采用流動相A和含有UV吸收能力不同的添加劑（例如0.05 mg/mL尿嘧啶或0.2％丙酮的乙腈溶液）的流動相B溶劑組成分級梯度進行測定。
表4：確定延遲體積的步驟。
圖20：用于測定分析型系統和制備型系統的系統體積的分級梯度。
色譜柱容量
在純化色譜分離中，保持目標化合物具有足夠的分離度是一個關注重點。色譜柱容量（或稱上樣量）以化合物與鄰近峰的分離度為衡量標準。雖然色譜柱容量主要受色譜柱柱長和內徑影響，樣品溶解性和樣品混合物的復雜性等其它因素對此也有一定影響。色譜柱容量的趨勢如下：
- 色譜柱容量主要取決于具體樣品的溶解性。
- 簡單混合物的色譜柱容量更高。
- 如果需要較高的分離度，應降低色譜柱容量。
- 色譜柱容量在很大程度上取決于上樣條件。
表5：常用制備型色譜柱規格的估計上樣量(mg)。
示例：以4.6 x 50 mm的色譜柱為例，其預計上樣量為每20 μL進樣對應3 mg。
在方法放大之前，應通過上樣量研究來確定特定目標化合物的理想上樣量。這些研究以小規模進行，并采用以下其中一種方法：制備高濃度樣品，然后逐步增大進樣體積；或者制備多個濃度的樣品，進樣體積保持恒定。這兩種方法的目標都是在保持目標化合物與鄰近雜質之間具有足夠分離度的前提下，確定可進樣的最大樣品濃度或進樣體積。確定色譜柱容量后，可利用公式將其放大，以便用于內徑更大的色譜柱和大規模工作流程。
圖21：上樣量研究?？梢钥吹叫翘枠俗⒌姆宓姆蛛x度隨上樣量增大而降低。
公式10：上樣濃度放大
因此，要將4.6 mm x 50 mm分析型色譜上1800 μg (1.8 mg)的上樣量等效放大至19 mm x 50 mm制備型色譜柱：
公式11：進樣體積放大
要放大20 μL的進樣體積：
柱頭稀釋
DMSO等強溶劑可以改善樣品溶解性，進而可能增大色譜柱容量。然而，進樣大體積的強溶劑會導致色譜峰畸變，這反而會減少可成功分離的產物量。若強溶劑從進樣器輸送到柱頭的過程中在水性溶劑流中間形成溶劑簇，就會導致峰畸變。溶劑簇邊緣的強樣品溶劑被水性溶劑稀釋，可能會引起樣品沉淀，這種沉淀可能會堵塞流路塞，進而導致高壓系統關閉。
圖22：流動相在色譜柱內稀釋樣品簇。如果使用強稀釋劑制備樣品，則樣品簇在流經含有水性流動相的色譜柱時，樣品簇邊緣可能會產生沉淀。
如果沉淀沒有導致系統關閉，樣品將進入色譜柱，但色譜柱上不會有樣品被保留，直到樣品簇被流動相稀釋。進樣體積較大時，樣品簇必須沿著色譜柱移動相當長的一段距離才能達到所需的稀釋度。在這種情況下，樣品沉積為寬譜帶，占據大部分色譜柱體積，這會導致需要大量洗脫液才能洗脫出很寬的峰，且峰分離度不足。通過嚴格限制進樣體積和上樣量可以避免這種情況。替代方法是用水或弱溶劑對樣品進行充分稀釋，以確保足夠的保留性能。
圖23：將樣品溶于強溶劑中進樣的傳統進樣方法。樣品簇在沿著色譜柱移動的過程中被稀釋，會導致峰畸變。
由于通量和回收率受到影響，上述兩種方法都不理想。柱頭稀釋系統采用另一種配置，能夠在色譜柱入口處使用水性稀釋劑流對輸送至此的樣品簇進行連續稀釋。輸送至色譜柱的流速非常快，因此不會產生沉淀。接下來，樣品分子會被吸附到填料上，形成非常窄的譜帶，進而被洗脫為分離良好的小體積峰。柱頭稀釋還使得樣品不容易在定量環或柱頭處發生沉淀，因此能改善系統穩定性。由于樣品組分峰之間的分離度得以改善，我們可以增大進樣量，從而減少分離所需的進樣次數。在實際操作中，采用柱頭稀釋通?？蓪⑸V柱上樣量提升3~5倍。發生高壓關閉的頻率降低，色譜柱壽命也更長。
圖24：柱頭稀釋系統。樣品簇被輸送到色譜柱入口，并在此經水性稀釋劑流連續稀釋，因而不會產生沉淀。樣品譜帶可洗脫為具有理想分離度的小體積峰?。
圖25：采用傳統進樣方法和柱頭稀釋法進樣溶于強溶劑的樣品結果對比。柱上進樣量為1000 μL（相當于133 mg）3。
流速放大
為了在放大過程中保障分離質量，小規模和大規模色譜柱的線性流速必須保持恒定，因此在柱長、粒徑和填料相同的大規模和小規模色譜柱之間進行流速放大效果十分理想。放大流速時必須考慮系統的硬件能力，例如最大泵流量和背壓限制。如果硬件無法滿足流速要求，應考慮更換合適的儀器以滿足放大要求。
公式12：流速放大
例如，假設分析型色譜柱(5 μm, 4.6 mm x 50 mm)的流速為1.5 mL/min，則制備型色譜柱(5 μm, 19 mm x 50 mm)的流速通過以下公式計算：
梯度持續時間放大
一般來說，如果可通過調節流速保持流動相線性速度不變，進行方法放大時不需要更改梯度。如果柱長不同，則必須計算梯度時間，以保持小規模分離時的分離度和保留時間。
公式13：梯度時間放大
例如，50 mm分析型色譜柱上持續5 min的線性梯度區段在100 mm制備型色譜柱上應為10 min：
制備轉換器
上樣量、流速和梯度的放大計算也可以通過制備型OBD方法轉換器執行。該轉換器是一款操作簡單的應用程序，可執行所有分析級到制備級的放大計算，包括上樣量、系統體積、流速、溶劑體積消耗量、質譜引導的色譜分離方法的分流比計算，以及梯度聚焦UPLC方法到制備級方法的轉換等。您可以通過www.waters.com/prepcalculator 或沃特世純化軟件（如ChromScope?）訪問該應用程序。
圖26：沃特世制備型OBD方法轉換器，可通過www.waters.com/prepcalculator 上的Web Toolbox（網絡工具箱）訪問。
