3.鬼峰問題

鬼峰問題	預(yù)防措施和解決方案
鬼峰
柱或注射器被污染 （色譜柱或進(jìn)樣器污染）	1.  僅使用HPLC級(jí)溶劑   2.  沖洗柱，以去除雜質(zhì)   3.  在注射器用于下一個(gè)分析物時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行沖洗
前一個(gè)注射導(dǎo)致的遲洗脫峰（前一次進(jìn)樣的后洗脫峰）	1.  延長運(yùn)行時(shí)間 2.  每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)用強(qiáng)流動(dòng)相沖洗色譜柱 3.  對(duì)于梯度運(yùn)行，應(yīng)以較高濃度結(jié)束（有機(jī)相比例結(jié)束梯度）
在RP HPLC中，水被污染	1. 使用HPLC級(jí)水
樣本中的未知（未知雜質(zhì)）干擾	1. 使用樣品清理（凈化措施）（例如SPE）
負(fù)峰
溶質(zhì)折射率低于流動(dòng)相（RI檢測器）	1. 使用折射率較低的流動(dòng)相   2. 調(diào)換檢測器極性以獲得正峰值
溶質(zhì)的吸收低于流動(dòng)相的吸收（溶質(zhì)的紫外吸收低于流動(dòng)相的紫外吸收）（UV檢測器）	1.  更改UV波長   2.  使用UV吸收較低的流動(dòng)相
樣品溶劑和流動(dòng)相的成分不同	1. 如可能，更換樣品溶劑并將樣品溶解在流動(dòng)相中 （更換樣品溶劑，如有可能，使用流動(dòng)相溶解樣品）
峰值（毛刺）
流動(dòng)相中存在氣泡	1. 對(duì)流動(dòng)相脫氣   2. 在檢測器出口端，安裝背壓限制器。   3. 確保所有配件安裝緊固
柱儲(chǔ)存時(shí)未使用端帽 （堵頭）	1.  柱儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)使用端帽   2.  用脫氣的甲醇沖洗RP柱

 

3.1.等度分離中出現(xiàn)的意外寬峰是因前次運(yùn)行產(chǎn)生的峰洗脫延遲（在等度分離中，前次運(yùn)行中的遲洗脫組分以寬峰的形式意外出現(xiàn)）。

對(duì)于等度分離，保留時(shí)間越長，峰應(yīng)（色譜峰）越寬；但色譜圖狹窄區(qū)域內(nèi)的所有峰應(yīng)具有大致相同的峰寬。如圖11（箭頭）所示，當(dāng)窄峰中出現(xiàn)寬峰時(shí)，可能是因?yàn)橹白⑸洌ㄇ按芜M(jìn)樣）的化合物發(fā)生了洗脫延遲。這很容易檢查。

只需進(jìn)行正常注射（進(jìn)樣），但將運(yùn)行時(shí)間延長兩到三倍。如果在正常運(yùn)行時(shí)間結(jié)束后出現(xiàn)峰值（出峰），那就是因洗脫延遲導(dǎo)致的。

可以通過延長正常運(yùn)行時(shí)間，以涵蓋此峰的洗脫（洗脫時(shí)間將峰洗脫出來）；也可以在每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)加入強(qiáng)溶劑沖洗液，以（來）清洗柱中的頑固物質(zhì)。

圖11.峰延遲洗脫通常在38.5分鐘時(shí)出現(xiàn)（遲洗脫峰（正常情況下在第38.5分鐘出現(xiàn)的洗脫峰）），位于（出現(xiàn)在了）下一個(gè)縮短的等度運(yùn)行的色譜圖的12.0分鐘（箭頭）處。來源[6]。

3.2.通過運(yùn)行非注射（無進(jìn)樣）空白梯度并觀察基線，可以分離梯度運(yùn)行中的鬼峰。

如圖12a所示，當(dāng)空白梯度出現(xiàn)過多的峰時(shí)，試劑污染可能是導(dǎo)致此問題的原因之一（可能是溶劑污染所致）。

在這種情況下，圖12a顯示運(yùn)行過程中的峰值（峰）非常小（1-3 mAU），并且在0.8-1.0 AU范圍內(nèi)的主要成分分析中幾乎沒有峰值（對(duì)0.8-1.0 AU大小的主要成分檢測峰沒有影響）；但是對(duì)于穩(wěn)定性（性指標(biāo)檢測）或雜質(zhì)的測定，1-2 mAU范圍內(nèi)的峰值應(yīng)需要量化（也需要定量）。

在這種情況下，則需要進(jìn)一步的研究。

在梯度運(yùn)行之間的平衡期間，流動(dòng)相中的非極性雜質(zhì)一般沉積（聚集）在柱的頂部位置。然后，在梯度過程中，像其它峰一樣，這些雜質(zhì)被洗脫出來。

通過將平衡時(shí)間延長至三倍，檢查問題的根源。如果空白梯度中的峰值（峰）增加約三倍，則水狀溶劑最有可能是問題的致因（則極可能是水溶液中的雜質(zhì)所致）。

如圖12b所示，可將水和/或添加劑換成純度較高的成分，以解決這一問題。

圖12. 運(yùn)行空白梯度：（a）A容器受到污染的水（A容器中溶劑有雜質(zhì)）和（b）A容器中純度較高的水。色譜柱：150x4.6mm C18；1.5mL/min；35℃；在255 nm處進(jìn)行UV檢測。梯度：0-83％ACN /水運(yùn)行13分鐘，并保持5分鐘。來源[7]。

3.3.等度或梯度運(yùn)行的負(fù)峰不如正峰常見（相對(duì)于正峰較為少見），但也會(huì)發(fā)生。

負(fù)峰在離子對(duì)或其它方法中更為常見，其中流動(dòng)相試劑在選定的檢測波長下具有顯著的紫外線吸光度（倒峰在有離子對(duì)或流動(dòng)相在檢測波段下有明顯紫外吸收的情況下更為常見）。

在這種情況下，背景吸光度將極為重要（背景吸收可能較顯著）（可能為0.5 AU或更多），但不會(huì)被注意到（較難覺察），因?yàn)橄到y(tǒng)在每次運(yùn)行開始時(shí)會(huì)自動(dòng)調(diào)節(jié)至零點(diǎn)，并檢測信號(hào)。

如果化合物的吸光度低于流動(dòng)相背景（背景吸光度），其會(huì)顯示為負(fù)峰。

致因的確認(rèn)和峰的消除方式與正峰相同（確認(rèn)問題來源并消除倒峰的方法與正峰相同）：檢查水、試劑或樣品的制備過程。